分子克隆实验专题--（五）感受态细胞的选择与使用
常用感受态细胞的特性：
top10，dh5α：蓝白斑筛选，高效克隆，质粒抽提
jm110：甲基化酶缺陷型
sure：克隆不稳定插入片段，降低同源重组
dh10b：文库构建，长片段质粒的克隆（150kp
    质粒转化）
stbl2：克隆不稳定插入片段，正向重复，逆转录病毒序列，克隆甲基化基因组序列。
stbl3：克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。
        选择适宜的感受态细胞
     序列的结构，长度，载体种类以及特殊要求等。
        选择适宜的转化方式
     热激转化：常规克隆，片段较短（<10kb)
     电转化: 建库，基因敲除，长片段（>10kb)
感受态细胞使用的注意事项
        连接产物或质粒的量
    效价：1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目，单位为cfu。
    化学感受态细胞：106，107，108，109cfu
    电转感受态细胞：108，109，1010cfu
    常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞，特殊转化（如建库）则选择感受态细胞，一般选用电转。
        感受态细胞效价测定
    标准质粒：puc18, puc19,pbr322
                      超螺旋，超纯
    质粒使用量：<5μl, <1ng
    设立阴性对照，多涂几板(3块以上）取平均值。
        化学感受态细胞的使用
     质粒pcr扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用dh5α高效感受态细胞进行转化。
     可能原因： dh5α本身不适合这种操作；高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。
      可选用top10感受态细胞。
        电转感受态细胞的使用
    尽量降低转化产物的离子浓度，防止细胞被击穿。
    大量的连接产物提纯后进行转化，或者进行透析后再转化，有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。
        氨苄平板的卫星菌落
     氨苄平板涂板后如果时间太长，就会产生卫星菌落，在单克隆周围生成小的克隆。
     氨苄抗生素只能抑制菌落生长，而不能杀死，当抗生素降解失效后，被抑制的菌体重新形成菌斑。
      解决方法：使用新鲜配置的氨苄培养基平板，提高氨苄的使用量，选用高质量的氨苄抗生素。
        感受态细胞的取用
     特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上，在制成之后要立即放入超低温冰箱。
     感受态细胞对温度的变化非常敏感，取用时要快取快放，不能将整包的细胞放在外面然后取用。
     看清标记，防止拿错。
上海淳麦生物科技有限公司  感受态细胞专家  4006815880