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属硅藻门 羽蚊纲 双菱形目(surirellales) 菱形藻科(nitzschiaceae) 菱形藻属(nitzschia),小新月菱形藻是海产经济双壳类动物幼虫良好的基础饵料。由于其个体小,繁殖快,营养丰富,运动速度适中,又无含纤维素的细胞壁[2~4],易被贝类幼虫捕捉吞食和消化吸收。因此,国内各双壳贝类育苗室都有培养
培养方式 培养条件:
1.温度:15-30℃
2.盐度:千分之10-40
3.照光:本藻照光不需太强,室外或窗户旁均可培养。
3.族群生长周期:如果没有陆续更新培养,培养一段时间(约60天)後,大部份藻细胞沉於底部,此时水色澄清;在此之前,取上浮藻细胞作种原,移植於新容器续代培养。
4.培养液填加量:培养容器1公升,一次添加2cc培养液,整个生长周期(约60天)不再追加。
5.敌害生物:为避免浮游动物和较大藻类感染滋生,培养容器如右图要加盖。容器务必洗乾净,需用海水素泡新鲜海水。使用天然海水需先杀死浮游动物。
一、采样和预备培养
首先要采集有需要分离藻类的水样,采回后在显微镜下检查。如发现需要分离的藻类数量较多时,可立即分离。若数量很少,最好先进行预备培养,待其增多后,再分离。采样时要同时测定水样的温度和盐度,供分离、培养时参考。
用作预备培养的培养液,各种藻类是不同的,对一些难以培养的藻类一般用原位海水较好。预备培养液营养成分浓度应小些,一般只有原配方的1/6~1/2。如水样中藻类种类较多,就应使用几种不同的培养液,使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。
可用三角烧瓶或试管作培养容器,加入培养液。然后把经100微米筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去,放在培养箱模拟现场参数进行培养。在培养附着藻类时,容器可静止不动;而培养浮游藻类时,应该每天摇动一次。
有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖,有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度,更换不同的培养基,加入原位海水就有可能获较好效果。 原位海水:采样点收集的海水,先后用100微米和0.45滤膜预过滤,使用前用0.22微米滤膜过滤。
二、 分离方法
微藻培养者根据各自的经验和习惯,创造了各式各样的藻种分离筛选方法,已有十几种之多。最常用的方法是微细吸管分离法、水滴分离法、稀释分离法、琼脂平板法。
1. 微细吸管(毛细管)分离法
此法是取得“单种”或“克隆”的最可靠的方法之一。选直径较细(约5毫米)玻管,在火焰上加热,待快熔时,快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样,置浅凹载玻片上,镜检。
先用猪眼睑毛做成的解剖针,将水滴中杂物和不需要的藻细胞,拨向一边,将所需的藻细胞拨向另一边;对于有趋光性的鞭毛藻,可在一侧投入光线,则所要选的鞭毛藻游向有光一侧,杂质留在原处,这样用玻璃微细吸管吸取所需的藻细胞就比较容易。
用微吸管挑选要分离的藻体,认真仔细地吸出,放入另一浅凹载片上,镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功,应反复几次,直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养。
另外,对个体较大的种类,可在双筒解剖镜下操作,将微细吸管内的藻细胞轻轻吹入浅凹栽玻片上或栽玻片上的水滴中,为达到纯培养,微藻细胞最好经数次洗涤,即吹入另一滴之后,再吸出吹入另一滴灭菌培养液水滴中,反复称出洗涤几次,最后经镜检确认水滴中是要筛选的一个藻细胞之后,再接种试管中,或将含有藻细胞的一段毛细管用消毒镊子夹断,放入接种试管中。
一般在96孔板每个孔接1~2个细胞个体。一般需要10天以上转接到24孔板。为了较长时期保存藻种,可将分离到的藻种用青霉素-硫酸链霉素(货号:sv30010,500~1000单位)处理后,获得较纯藻种。
此法操作技术要求高,要细心。往往吸取一个细胞,要反复几次才能成功,且适于分离个体较大藻类。
2. 水滴分离法
用微吸管吸取稀释适度藻液,滴到消毒过载片上,水滴尽可能滴小些,要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2~4滴,间隔一定距离,作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体,无其他生物混杂,即用吸管吸取培养液,把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功,需反复重做,直到达到目的。
此法简便易行,尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真,使用工具及培养液经严格消毒。
3. 稀释分离法
把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样,取其一定量,用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法,达到把原混杂生物单个分离培养的目的。
首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞(也可能一个都没有,也可能有两个),在稀释过程中配合显微镜检查,调节稀释度,然后准备装有1/4容量培养液的试管20支,每一试管加入稀释适宜水样一滴,摇匀,进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时,再检查是否达到分离目的,若未达到,再重复做。
此法操作简单易行,但有一定程度盲目性,比不上水滴分离法效果好。
4. 琼脂平板法
对分离能运动的羽纹硅藻类、鞭毛型绿藻类最为适宜,方法易于掌握。按所要分离的藻类的特性,选用合适的培养液,在培养液中加入1~1.5%的琼脂,加热将琼脂溶化。加热后要加淡水补充蒸发掉的水分。然后,按照微生物学中固体培养基的制作方法倒平板、灭菌。
在无菌操作箱中,用接种针蘸取少量藻液,在固体培养基上划蛇形线,藻细胞就会散布在琼脂培养基的表面。
另一种使藻细胞散布在培养基表面的方法是用医用口腔喷雾器,将经稀释的藻液喷在培养基的表面。
将接种好的培养皿放在有适合的光照和温度的地方培养。一般经过十来天的培养就会在培养基上长出相互间隔的藻落。通过显微镜检查,找出所要的纯的藻落,再用已消毒的接种针从培养基上挑取藻体群落,移入经灭菌的培养液中培养。反复几次,就能得到纯种培养物。
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藻种采用离心管包装,15/50ml,parafilm封口膜包被。
购买人需保证所购藻种不得向第三方提供。
注意事项:
1、 收到藻种后,应先拧松管盖,放在合适的光照、温度下培养一个光暗周期,或者在光照下培养六个小时以上,然后按照1:3-1:10的比例转接。若没有培养经验,建议先转接一部分。剩下一部分等体积转接备用。
2、采用指定的培养基,其中硅藻需要添加硅酸盐。
3、生长稳定后,如果有白色絮状沉淀,用抗生素(青霉素+链霉素 货号:sv30010,浓度在千分之五)处理24小时,进一步活化细胞。蓝细菌污染使用抗生素如卡纳,氯霉素50-100μg/ml,(可配成100mg/ml的储备液,使用时稀释1000倍),加完后等到密度长到od值是1时,依次稀释涂板,从10倍稀释到1000000倍,然后分别涂板,长出来就是好的。
霉菌污染可选择放线菌酮,不过霉菌孢子繁殖到处都是。可以尝试加抗生素在滤纸上吸附培养一段时间,藻密度到一定程度,会形成优越性,不断划线也可以。霉菌很要命,有保存的建议重新活化。
4、细胞收集一般用离心法,如果要是收集之后还要继续培养则需要低速离心。200-800g 离心。
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