镍-琼脂糖凝胶ff
品  名
镍-琼脂糖凝胶ff
英文名
nickel nupharose fast flow, ni nupharose ff
目录号
nrpb07s(预装柱)
规  格
1 ml预装柱，5ml预装柱，10 ml预装柱，特殊规格订制
运  输
2 ~30℃，常压、避光
贮  存
20%乙醇，2 ~25℃
保质期
5年
相关介绍：
镍-琼脂糖凝胶ff以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联亚氨基二乙酸（ida），再螯合ni2+。其中ida是金属螯合层析中最常用的配体，与次氮基三乙酸（nta）相比，具有亲和力强，载量高，可再生重复使用的特点。
镍-琼脂糖凝胶ff主要用于纯化带组氨酸标签（his-tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属ni2+形成稳定的配位键，因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了his-tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶ff一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。
技术指标：
基质
4%琼脂糖凝胶
配基
-n(ch2cooh)2
配基密度
≥25 μmol/ml
填料粒径
60 ~180 μm
最大流速
800 cm/h
推荐流速
50 ~100 cm/h
ph稳定性
ph 5 ~12，ph 3 ~14（脱镍）
耐反压
0.3 mpa
载量
≥40 mg his-tag重组蛋白/ml
使用方法：
1. 色谱柱装填
1.1 所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一至，液体最好做脱气处理。
1.2 在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。
1.3 将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。
1.4柱压不超过0.3 mpa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于300 cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。
1.5填装好的镍-琼脂糖凝胶ff柱用2 ~5个柱体积的初始缓冲溶液平衡，建议流速100 cm/h，平衡后的柱子可以用于his-tag重组蛋白的上样和洗脱纯化。
2. 上样
2.1 样品一般溶解在ph6 ~8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的ph值，可以增大载量。
2.2 缓冲液中不能含有edta和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇、dtt等还原剂。
2.3常用缓冲液有10 ~ 100 mm 磷酸钠缓冲液、20 ~ 200 mmtris-hcl缓冲液等。
2.4在缓冲液中一般要加入0.15 ~0.5 m的nacl，以消除离子交换作用。
2.5在初次使用镍-琼脂糖凝胶ff，推荐使用50 mmpbs（50 mm nah2po4，0.5 m nacl，naoh调节ph 7.4）作为初始缓冲液。
3.洗脱
3.1 镍-琼脂糖凝胶ff最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。
3.2咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用hcl进行调节ph。
3.3在初次使用镍-琼脂糖凝胶ff，不知道洗脱的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mm、20 mm、50 mm、100 mm、200 mm、500 mm咪唑，浓度从低到高，分别洗脱和收集，通过sds-page电泳等方法鉴定。
3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。
拓展应用：
1.更换不同的螯合离子
1.1ida螯合的镍-琼脂糖凝胶ff可以用edta脱掉镍，脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0mnaoh进行清洗凝胶，再重新螯合镍，使凝胶焕然一新。也可以螯合其他金属离子，如cu2+，zn2+，co2+，fe3+等，进行多样纯化。
1.2 脱镍方法：用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5 ~10个柱体积的100 mm edta淋洗柱子，再用2 ~ 3个柱体积的0.5 m nacl洗掉残留的edta。
1.3螯合金属离子方法：用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子，用0.1 ~0.3m金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属，螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。
1.4金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐，如为niso4、cuso4、znso4、cocl2、pbso4等，金属盐溶液应中性或弱酸性，且必须经过过滤，以防止金属盐在胶上沉淀。
1.5 如果是fe3+必须在低ph下螯合（ph3），以防止fe3+产生沉淀，一般可以加入少量盐酸和硫酸保持ph。
2.多种洗脱方法
2.1 降低ph洗脱：大多数蛋白在ph 4 ~ 6会被洗脱下来，也可以在ph3 ~ 4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸或磷酸盐缓冲体系。
2.2 竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0 ~ 0.5 m咪唑，0 ~50 mm组氨酸，0 ~ 2 m nh4cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定ph下进行。
2.3螯合剂洗脱：edta、egta等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。
2.4 所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 m的nacl以消除离子交换作用。
2.5 当螯合离子配基是cu2+时，有以下的三种操作方式。
降低ph洗脱：
上样缓冲液：50 mm nah2po4，0.5 m nacl，ph 7.4
洗脱缓冲液：50 mm nah2po4，0.5 m nacl，ph 3.5
竞争性洗脱：
上样缓冲液：50 mm nah2po4，1 m nacl，ph 7.4
洗脱缓冲液：50 mm nah2po4，1 m nh4cl，ph 7.4
螯合剂洗脱：
上样缓冲液：50 mm nah2po4，0.5 m nacl，ph 7.4
洗脱缓冲液：50 mm nah2po4，0.5 m nacl，50 mmedta，ph 7.4
注：配制的缓冲液需要用naoh或hcl调节至要求的ph。使用降低ph和螯合剂洗脱会使金属离子脱落，下次使用得重新螯和金属离子，最常用的为竞争性洗脱。
再生、清洗：
1.凝胶的再生
1.1 多次使用后或需要更换螯合的金属离子，必须将胶脱镍再生。脱镍方法：用5 ~10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5 ~ 10个柱体积的100 mm edta淋洗柱子，再用2 ~ 3个柱体积的0.5 mnacl洗掉残留的edta。
1.2 多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用0.1 ~ 1.0 mnaoh反向清洗柱子，流速50 cm/h，保持1 ~ 2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。
1.3 清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子，用0.1 ~0.3m金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属，螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。
2. 在位清洗
2.1 除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2 ~ 3个柱体积2 m的nacl溶液反向清洗柱子。
2.2除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。
2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，参照凝胶的再生。
注意事项：
推荐流速
预装柱体积
1 ml
5 ml
10 ml
流速(ml /min)
0.2
1
2

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