小反刍兽疫病毒荧光rt-pcr检测试剂盒说明书20151201版
编号：ka001.01yb
规格：50头份
原理：本试剂盒采用rt-pcr方法结合荧光探针的扩增检测技术，通过荧光信号的变化检测小反刍兽疫病毒rna，用于多种样本小反刍兽疫病毐rna的检测。
试刑盒组成
组成成份
体积
样本处理试剂
裂解液
15ml x 2瓶
核酸扩增试剂
depc水
1ml x l 管
rt-pcr反应液
750ul x l管
rt-pcr酶
1颗/管x 12管
taq酶
15ul x l管
阴性对照
1000ul x l管
阳性对照
loooul x l管
保存期及贮藏条件：本产品-20℃避光可保存12个月。
自备试剂：
氯仿、异丙醇（-20℃预冷）、75%乙醇（用pnase、dnase free水配置）
样品收集，操作和储存
1. 最好选择发病早期，无菌采样并立即送往实验室进行病毒检测。
2. 样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在-20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。
检测步骤
1.样本处理
1.1 取n个1.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+ 1管阳性对照），作好标记。
1.2 首先加600ul裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul，再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec(不置过于强烈,以免产生乳化，也可用手颠倒混匀)
1.3 12000g离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。
1.4 取与步骤1.1中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇（-20℃预冷），作好标记。吸取步骤1.3各管中的上清液相转移至相应的管中（注意不要吸出中间层，该层富含 dna和蛋自质），颠倒混匀。
1.5 12000g离心15min (注意固定离心管方向）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干)；加入600ul75%乙醇，颠倒洗涤。
1.6 12000g离心l0min，(注意固定离心管方向）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。
1.7 4000g离心10sec,(注意固定离心管方向)。将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室溫干燥1-5min (不宜过于干燥，以免rna不溶）。
1.8 加入11ul depc水，轻轻混匀，溶解管壁上的rna；2000g离心5sec,冰上保存备用（注意：此时的rna最易受rna酶降解，请在2小时内进行pcr扩增）。
2.扩增试剂准备(pcr前准备区）
   从试剂盒中取出相应的rt-pcr反应液、taq酶，在室溫下融化后，2,000rpm离心5sec。设所需pcr管数为n (n =样本数+ 1管阴性对照+ 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂
用量
rt-pcr反应液
15 ul
taq酶
0. 25 ul
计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积的离心管中，向其中加入n/4颗rt-pcr酶颗粒，充分混合均匀，2,ooorpm离心losec；向每个pcr管中各分装15ul，转移至样本处理区。
3.加样（样本处理区）
    在各设定的pcr管中分别加入上述样本处理步骤1.8中制备的rna溶液各l0ul，盖紧管盖，于2,ooorpm离心5sec。将pcr管排好放入pcr荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。
4. rt-pcr反应（检测区）
4.1 循环条件设置 i
步骤
循环数
温度
时间
数据收集位点
1
1
42
30 min
none
2
1
92
3 min
none
3
5
92
10 sec
none
45
30 sec
none
72
60 sec
none
4
40
92
10 sec
none
60
30 sec
收集荧光
5
1
40
00 sec
none
反应体系为25ul。
4.2 仪器检测通道选择：如有需要，荧光信号收集时设定为fam荧光素。
结果成立原则
1.阴性对照的ct值应为none。
2.阳性对照的ct值应小于等于28.0。
以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
结果判断
1.ct值为none的样本为阴性。
2.ct值小于等于30.0的样本为阳性。
3.ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果ct值为none为阴性，否则为阳性。
4.对于某些未呈现s型曲线，但本底较高的样本，应为阴性。
注意事项
1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
2.pcr整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。
3.使用不含荧光物质的一次性手套，一次性离心管。
4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.
5．-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000 rpm离心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。
6．在rna提取过程中，避免rna酶污染，尽量缩短操作时间。
7．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
8.pcr反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。
9.不同批次的试剂盒勿混用。

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