禽流感病毒通用型和新城疫病毒通用型（二合一）实时荧光qrt-pcr检测
试剂盒（柱式提取）
一、简介
禽流感病毒通用型和新城疫病毒通用型（二合一）实时荧光qrt-pcr检测试剂盒是在同一个试剂盒中，可以检测两种项目的商品化检测试剂盒。该试剂盒中检测禽流感病毒通用型和新城疫病毒通用型的反应液是分开的，用户可以根据自己的需求，同时做两个项目的检测，或者只做其中的一个。
禽流感病毒通用型实时荧光qrt-pcr检测试剂是按照美国农业部（usda）的国际检测标准和我国《禽流感病毒通用荧光rt-pcr检测方法》（gb/t 19438.1-2004）而制备的。其探针报告基团为fam，淬灭基团为none。本方法可定性检测所有亚型禽流感病毒。
新城疫病毒通用型实时荧光qrt-pcr检测试剂是按照美国农业部（usda）的国际检测标准而制备。其探针报告基团也为fam，淬灭基团为none。本方法可定性检测所有毒力的新城疫病毒。
二、用途
本试剂盒适用于检测各种禽类喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液及细胞培养液等。可用于禽流感病毒以及新城疫病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。
三、试剂盒组成（40/kit）
序号
组成成份
数量
规格
序号
组成成份
数量
规格
1
禽流感通用荧光qrt-pcr反应液（aiv-qrt-pcr mix）
1管
560μl/管
7
cr1试剂
1瓶
24ml/瓶
2
新城疫通用荧光qrt-pcr反应液（ndv-qrt-pcr mix）
1管
560μl/管
8
cr2试剂
1瓶
24ml/瓶
3
酶混合物（enzymes mix）
2管
40μl/管
9
cr3试剂
2瓶
24ml/瓶
4
阴性对照（ntc）
2管
50μl/管
10
cr4试剂
1管
2ml/管
5
禽流感通用阳性对照（aiv -ptc）
1管
50μl/管
11
0.2ml pcr管
1包
40个/包
6
新城疫通用阳性对照（ndv -ptc）
1管
50μl/管
12
吸附柱及收集管
1包
40套/包
四、储存条件及有效期
荧光定量pcr试剂盒（小盒）于-18℃以下保存，有效期为6个月；rna提取试剂盒（大盒）于常温保存，有效期为12个月。
1.5ml离心管、移液器、吸头等请自备。
五、荧光pcr仪器适用范围
abi系列，roche系列等荧光定量pcr检测仪等。
六、样品的采集与rna提取
6.1 样品的采集
按照国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(gb/t 18936-2003 )和《禽流感病毒通用荧光rt-pcr检测方法》(gb/t 19438.1-2004 )进行样品的采集。
按照国家标准《新城疫诊断技术》（gb/t 16550-2008）和《新城疫检疫技术规范》（sn/t 0764-2011）进行样品的采集。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22-25℃）放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2ml，注入含edta（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500µl pbs或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无rna酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨（最好置于冰上或加入液氮），再加1ml生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5ml灭菌离心管中。
6.2 样品rna提取
6.2.1 取无rna酶的1.5 ml离心管，做好标识；
6.2.2 加入200µl样品，600µl cr1试剂，充分颠倒混匀，室温静置10min；
6.2.3 再加入600µl cr2试剂，颠倒混匀；
6.2.4 分别吸取650µl混合液转入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管；
6.2.5 再将剩余混合液转入该吸附柱中，重复步骤6.2.4；
6.2.6 向吸附柱中加入600µl cr3试剂，12000rpm离心1min，弃去收集管中液体，套回收集管；
6.2.7 重复步骤6.2.6，充分洗涤；
6.2.8 空柱12000rpm离心2min；
6.2.9 打开离心管管盖，室温干燥5min；
6.2.10将吸附柱放置于新的无rna酶的1.5 ml离心管中，在膜中央加入25µl cr4试剂，室温静置1min，12000rpm离心1min，收集rna溶液，-20℃保存，长期保存于-80℃。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5µl加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
七、 检测步骤
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qrt-pcr反应液（aiv-qrt-pcr mix和ndv-qrt-pcr mix）、酶混合物（enzymes mix），冰上融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的pcr反应管管数为2n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），n个反应管用于禽流感病毒通用型实验，另外n个反应管用于新城疫病毒通用型实验。
禽流感病毒通用型反应体系a配制如下表：
试剂
每个反应加入的量
n个反应加入的量
aiv荧光pcr反应液
14µl
n ×14µl
酶混合物
1 µl
n × 1 µl
总量（total volume）
15µl
n ×15µl
新城疫病毒通用型反应体系b配制如下表：
试剂
每个反应加入的量
n个反应加入的量
ndv荧光pcr反应液
14µl
n ×14µl
酶混合物
1 µl
n × 1 µl
总量（total volume）
15µl
n ×15µl
计算好各试剂的使用量，反应体系a和b分别加入到一个适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s。
向设定的n个pcr反应管中分别加入15μl反应体系a，向每管中加入处理后样品/阴性对照（ntc）/阳性对照（aiv-ptc）5μl，10,000rpm瞬时离心10秒。
再向设定的n个pcr反应管中分别加入15μl反应体系b，向每管中加入处理后样品/阴性对照（ntc）/阳性对照（ndv-ptc）5μl，10,000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qrt-pcr反应条件
将各反应管放入实时荧光pcr仪器的反应槽内。推荐循环条件：
反转录（reverse transcription）
1循环
45°c for 5 min
预变性
1循环
94°c for 30 sec
pcr扩增（pcr amplification）
40循环
94°c for 5 sec
60°c for 30 sec
在60°c 延伸时收集荧光信号。aiv和ndv的报告基团：设置均为fam。
八、 结果分析
8.1 结果分析条件设定
    直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照（ntc）：不应产生任何的扩增曲线。 
（2） 阳性对照（aiv-ptc & ndv-ptc）：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
a 禽流感病毒通用型
（1） 在试验成立的条件下，ct值≤30的样本为阳性，表明aiv核酸阳性。
（2） ct值显示为无的样本为阴性样本，表明aiv核酸阴性。
（3） 如果30＜ct值≤35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行aiv qrt-pcr检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明aiv核酸阳性；否则判为样本阴性。
b 新城疫病毒毒株
（1） 在试验成立的条件下，ct值≤30的样本为阳性，表明ndv核酸阳性。
（2） ct值显示为无的样本为阴性样本，表明ndv核酸阴性。
（3） 如果30＜ct值≤35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行ndv qrt-pcr检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明ndv核酸阳性；否则判为样本阴性。
九、注意事项
（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
（2） 所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含rna酶。
（3） pcr操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、pcr扩增区等)，防止实验室污染。
（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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