产品及特点 构巢曲霉(aspergillus nidulans.)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢
科、曲霉属的一种真菌，分布于粮食、土壤和空气中。曾用作真菌遗传学研究材
料。作为质控菌种，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型
科研提供严格质量体系控制的 atcc,cmcc,cicc,dsmz 标准菌株。因此快速
检测构巢曲霉具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 pcr 技术为基础开
发的专门检测构巢曲霉的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 dna 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据构巢曲霉高度保守区设计，不会跟其他微生物的 dna
发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μl 体系的探针法荧光定量 pcr 反应。
6. 本产
3. 在 7 号管中加入 5 μl 1×10e8 拷贝/μl 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震
荡 1 分钟，得 1×10e7 拷贝/μl 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μl 1×10e7 拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所
得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10e6 拷贝/μl 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μl 1×10e6 拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所
得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10e5 拷贝/μl 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 dna 的制备
7. 如果有 n 个样品，设置 n+2 个提取，多出的一个是 pc（样品制备阳性
对照），一个是 nc（样品制备阴性对照）。可以用 10μl 阳性对照的 10000
倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为
pc。另外用水作为 nc。
8. 用自选方法纯化样品的 dna，本试剂盒跟市场上大多数真菌 dna 提取试剂
盒兼容。也可以选购本公司的真菌 dnaout 或柱式真菌 dnaout。本试剂
盒免费赠送 20 次免 dna 提取的天净沙核酸释放剂，本产品的裂解液可以
直接作为 pcr 模板，省略了 dna 提取步骤。
三、probe qpcr 反应（20μl 体系，在样品制备室进行）
9. 如果进行定量分析，则标记 n+9 个 pcr 管，其中 n+2 个用于上步得到的
n+2 个样品，1 个用于 pcr 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定
性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。
以下只介绍定量分析的反应设置。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设
置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好
后最后加）：
成分
样品管
n+2 个
pcr 阴性
对照管
标准曲线
样品管（2-7 管）
2×probe qpcr magicmix 10 μl 10 μl 各 10 μl
构巢曲霉探针法 qpcr 探针 1 μl 1 μl 各 1 μl
构巢曲霉探针法 qpcr
引物混合液
2 μl 2 μl 各 2 μl
n+2 个待测样品 dna 模板 6 μl 不加 不加
自备超纯水 不加 6 μl 不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液
（2-7 号）
不加 不加
各 6μl（2 号样到 2
号管，3 号样到 3 号
管…）
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 pcr：
过程 温度 时间
预变性 94℃ 5 min
pcr 反应
（40 个循环）
94℃ 0.5 min
55℃
0.5 min（采集 fam 通道的荧
光信号）
72℃ 0.5 min
五、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 ct
值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 ct 值从标准曲线上推算出样品
dna 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 ct 必须大
于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，ct 值应该
小于或等于 30。对待测样品，如果其 ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小
于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 ct
值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。 关联产品 构巢曲霉 lamp 检测试剂盒

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