基础知识背景 — 什么是小g蛋白？
小g蛋白(small g protein)因分子量只有20—30kd而得名，同时具有gtp酶活性，小g蛋白家族成员在细胞信号通路中发挥分子开关的功能，参与调控很多生物学过程。小g蛋白的共同特点是，当结合了gtp时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当gtp水解成为gdp时（自身为gtp酶）则恢复到非活化状态。这一点与g蛋白里的gα类似，但是小g蛋白的分子量明显低于gα。
在细胞中存在着一些专门控制小g蛋白活性的小g蛋白调节因子，有的可以增强小g蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, gef）和鸟苷酸解离抑制因子（guanine nucleotide dissociation inhibitor, gdi），有的可以降低小g蛋白活性，如gtp酶活化蛋白（gtpase activating protein, gap）。
第一个被发现的小g蛋白是ras，它是ras基因的产物。小g蛋白的ras超家族由超过150个成员组成，基于它们的序列同源性，被分成若干亚家族，例如rho，ras，ran，rab，arf和rad / rem / gem / kir。
小g蛋白超家族成员及其相关功能：
ras
细胞增殖
diras1; diras2; diras3; eras; gem; hras; kras; mras; nkiras1; nkiras2; nras; rala; ralb; rap1a; rap1b; rap2a; rap2b; rap2c; rasd1; rasd2; rasl10a; rasl10b; rasl11a; rasl11b; rasl12; rem1; rem2; rerg; rergl; rrad; rras; rras2
rho
细胞骨架的动力与形态
rhoa; rhob; rhobtb1; rhobtb2; rhobtb3; rhoc; rhod; rhof; rhog; rhoh; rhoj; rhoq; rhou; rhov; rnd1; rnd2; rnd3; rac1; rac2; rac3; cdc42
rab
膜转运
rab1a; rab1b; rab2; rab3a; rab3b; rab3c; rab3d; rab4a; rab4b; rab5a; rab5b; rab5c; rab6a; rab6b; rab6c; rab7a; rab7b; rab7l1; rab8a; rab8b; rab9; rab9b; rabl2a; rabl2b; rabl4; rab10; rab11a; rab11b; rab12; rab13; rab14; rab15;rab17; rab18; rab19; rab20; rab21; rab22a; rab23; rab24; rab25; rab26; rab27a; rab27b; rab28; rab2b; rab30; rab31; rab32; rab33a; rab33b; rab34; rab35; rab36; rab37; rab38; rab39; rab39b; rab40a; rab40al;rab40b; rab40c; rab41;rab42; rab43
rap
细胞粘附
rap1a; rap1b; rap2a; rap2b; rap2c
arf
囊泡转运
arf1; arf3; arf4; arf5; arf6; arl1; arl2; arl3; arl4; arl5; arl5c; arl6; arl7; arl8; arl9; arl10a; arl10b; arl10c; arl11; arl13a; arl13b; arl14; arl15; arl16; arl17; trim23, arl4d; arfrp1; arl13b
ran
核运输
ran
rheb
mtor途径
rheb; rhebl1
rgk
rrad; gem; rem; rem2
rit
rit1; rit2
miro
线粒体转运
rhot1; rhot2
ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；rab蛋白则参与调控细胞内膜交通（membrane traffic），其他家族成员也在细胞信号通路中发挥着非常重要的作用。
因此，研究gtp酶（gtpase）的活化调控机制具有广泛而深远的生物学意义。
传统检测rho 蛋白活化水平的方法主要为pull-down检测。pull-down法往往存在耗时长、需要样本量大、不太适合高通量检测等缺点。为克服传统方法这些方面的缺点，cytoskeleton公司开发了新一代的g-lisa™检测方法，用于快速简便地检测gtp酶活化水平。
g-lisa实验原理及操作步骤
1.首先将效应蛋白的受体结合域（rbd）包被96孔板；
2.样本中gtp(活化状态)结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而gdp(无活性状态)结合形式蛋白则不结合；
3.洗去未结合的蛋白；
4.然后依次加入特异性的一抗和hrp-二抗进行孵育结合；
5.最后利用合适的酶底物opd或化学发光试剂显色。
swiss 3t3 细胞中，activators活化的rho蛋白（左）和rac蛋白（右）
传统pull down法和g-lisa法的比较
原理
用包被效应蛋白的亲和磁珠选择性的结合有活性的gtpase，用western blot检测信号
用包被效应蛋白的96孔板选择性的结合有活性的gtpase 用elisa检测信号
实验设备
sds-page、western blot相关仪器
elisa相关仪器
上样量
300 - 2000 µg per assay
5 - 50 µg per assay
样品数量
up to 10 samples
up to 96 samples (or more)
结果定量
wb具有很窄的线性范围。此外，样品的多次操作也会导致某种程度上的变异分析。
提供精确定量的数字读数
反应时间
10-12h
＜3h
g-lisa法对比传统的pull down，主要有操作简便、上样量少、可同时检测多个样本、反应时间短、定量结果准确、与小鼠、大鼠和人的组织和细胞兼容等优势。
小g蛋白活化检测试剂盒pull-down实验结果展示：
lanes 4 & 5:10 ng/ ml of egf， 2min
lanes 2 & 3: persistent serum starvation
lanes 1: 20 ng of recombinant rac1-his protein run as a western blot standard
小g蛋白活化检测试剂盒g-lisa实验结果展示：
分别用cn01（蓝色activators）和lpa（红色）处理后rhoa的活化进程