klh蛋白和多肽通过smcc偶连实验记录-bs3/spdp/dss
smcc是一类含有n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂.可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。该交联试剂可渗透到细胞膜的脂质双层中，nhs活性酯与伯胺在ph7-9的环境形成酰胺键。马来酰胺与巯基在ph6.5-7.5的环境下形成稳定的硫醚键。在水溶液中，nhs活性酯的水解是（与氨基的反应）个竞争反应。马来酰胺比nhs稳定，但是在ph大于7.5时，马来酰胺会慢慢水解，失去与巯基反应的特异性。因而，在使用smcc时通常是在ph7.2-7.5的环境下进行，并且先让nhs发生反应。
smcc结构里的环己烷环可以降低马来酰胺的水解速率。这使得蛋白质在用smcc修饰之后可以冻干存放一段时间。很多蛋白质都选用该试剂来进行马来酰亚胺修饰。
klh (keyhole limpethemocyanin)，即血蓝蛋白，是在某些软体动物、节肢动物(蜘蛛和甲壳虫)的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。其分子量45０ ０00～１30 000。由于klh比bsa有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白。
用smcc来制备抗体-酶或者半抗原作载体的蛋白质，经常采用两步合成法。首先，含有氨基的蛋白质与几倍的偶联剂反应，反应结束后通过脱盐柱或者透析的方法除掉没有反应完的smcc。然后，再与含有巯基的蛋白质反应。在实际操作中要注意的是，smcc怕潮湿，存放时要和干燥剂一起存放。并且使用中从冰箱拿出来时要先在室外放置一段时间平衡温度，以免立刻开启，空气中水分遇冷凝结，破坏smcc 结构。
1、 将 20 mgsmcc（这是联接40条多肽的量）溶于2 ml dmf。
2、 将0.8 mlklh加入到25 ml圆底烧瓶中，补加1×pbs(ph 7.2)使蛋白终浓度为15 mg/ml。
3、 将溶解好的smcc溶液缓慢滴加到120mg klh 蛋白体系中，室温搅拌反应1h。
4、 用1 l1×pbs (ph 7.4) 溶液于4℃下透析 6 小时，除去游离的smcc。
5、 将透析后的klh蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的klh蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5 mg klh-smcc溶液转移到5 ml离心管中。
例如：反应前加入klh蛋白的量为120 mg，透析后的klh蛋白体积为20ml，那么透析后的klh蛋白浓 μlklh-smcc溶液转移到5 ml离心管中。
6、 将 3.0 mg多肽用 0.6 ml 1×pbs (ph 7.2) 溶液溶解。
注意：这里多称量出0.5 mg多肽是用来做elisa检测的，取出100μl即可。检测多肽随交联好的抗原一起寄出，浓度为5 mg/ml。
7、 用ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μl ellman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用nano分光光度计在λ=412nm下测其紫外吸收值，如果od值>0.15做 下一步；od值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；od值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。
ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。
8、 将多肽液滴加到klh-smcc管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。
用ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100 μl ellman试剂储备液，再加入10 μl 教练后的多肽溶液，用nano分光光度计在λ=412 nm下测定紫外吸收值。od值<0.03说明多肽和klh蛋白交联率已达到80%以上；od值>0.03则再补加smcc活化好的klh蛋白继续交联。如果ellman试剂显黄色说明多肽与klh蛋白偶联不完全；如果ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与klh蛋白偶联
西安凯新生物科技有限公司是国内知名的蛋白交联剂生产和销售商，我公司实验室生产高纯度的蛋白交联剂包含有spdp，smcc，pdph，mbs，sba，smpb，bs3，dss ，bs2g，dsg等等，产品纯度大于95% 价格比进口便宜50%以上 且大量屯有现货：
产品列表：
sulfo-nhs，n-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，cas#: 106627-54-7
biotin-onp，(+)-生物素-4-硝基苯酯，cas#: 33755-53-2
biotin-pfp，五氟苯酚生物素酯/生物素五氟苯酯，cas#:120550-35-8
6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯，cas#:55750-63-5
6-maleimidohexanoic acid，cas#：55750-53-3
n-maleoyl-β-alanine（mpa），cas#：7423-55-4
4-maleimidobutyric acid（mba），cas#：57078-98-5
11-马来酰亚胺十一烷酸 n-琥珀酰亚胺酯，cas#：87981-04-2
2-马来酰亚胺基乙酸，cas#：25021-08-3
11-maleimidoundecanoic acid（kmua）cas#：57079-01-3
sulfo-emcs, ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯 cas#：215312-86-0
amas, cas#：55750-61-3
1,2-bis(maleimido)ethane, cas#：5132-30-9
boc-6-ahx-osu, cas#：51513-80-5
n-boc-2,2-(ethylenedioxy)diethylamine ,cas#：153086-78-3
n,n,n,n-tetramethyl-p-phenylenediamine,cas#：100-22-1
n-succinimidyl 6-biotinamidohexanoate, cas#：72040-63-2
n-(+)-biotinyl-6-aminohexanoic acid cas#：72040-64-3
cas#：127062-22-0
dtssp
bs3 cas#: 82436-77-9
bs2g
bsg cas#: 79642-50-5
dsp cas#: 57757-57-0
dss cas#: 68528-80-3
dtssp cas#: 81069-02-5
egs cas#: 70539-42-3
sulfo-egs
dsseb cas# 23024-29-5
bmps cas#: 55750-62-4
emcs cas#: 55750-63-5
gmbs cas#: 80307-12-6
lc-spdp
mbs cas#: 58626-38-3
pdph
sba cas#: 42014-51-7
sia cas#: 39028-27-8
smcc cas#: 64987-85-5
smpb cas#: 79886-55-8
smph
spdp cas#: 68181-17-9
sulfo-lc-spdp
sulfo-mbs
sulfo-sanpah cas #: 102568-43-4
sulfo-smcc cas#: 92921-24-9
biotin hydrazide cas #: 66640-86-6
nhs-biotin cas#: 35013-72-0
nhs-ss-biotin cas #: 142439-92-7
sulfo-nhs-biotin
hpg cas#: 24645-80-5
sata cas#: 76931-93-6
sulfo-nhs acetate cas #: 152305-87-8
biotin-maleimide
biotin ethylenediamine hydrobromide cas# 216299-38-6
biotinamidohexanoic acid hydrazide cas#: 109276-34-8
cas#: 89889-52-1
tsat
bmph cas#:359436-61-6
emch cas#:151038-94-7
kmuh cas#:1593661-78-9
bmoe cas:5132-30-9
bmb cas#:28537-70-4
bmh (bismaleimidohexane) cas#:4856-87-5
tmea
dtme cas#:71865-37-7
satp cas#:84271-78-3
emca cas:55750-53-3
aedp
以上资料源于西安凯新生物科技有限公司
如有其他信息或产品信息咨询请致电我们
西安凯新生物科技有限公司