实验方法原理 sd胎鼠脑皮层神经元体外培养7 d ，微量移液器塑料滴头于培养孔内机械性划割培养之神经元，依划割程度不同分为轻、中、重3组，对照组除不进行机械性划割，其余处理同损伤组，伤后不同时间点（10，30 min ， 1，3，6，12，24 h）检测细胞存活率及培养液上清乳酸脱氢酶(ldh)含量。
实验材料 sd大鼠
试剂、试剂盒 硼酸硼砂缓冲液胰酶-edta 消化液d-hanks’
仪器、耗材 眼科剪滴管离心机培养皿 co2培养箱
实验步骤
一、实验步骤
1. 孕16 d sd 大鼠经麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的d-hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-edta 消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(dmem＋10%fbs)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的 dmem＋10%fbs 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(dmem＋20%fbs)并吹打 成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按1.5x105/cm2 种入6 孔板内，放入co2 孵箱中培养。培养48 h 后换液并 加入ara-c使其终浓度为 1x10-5 mm/l。ara-c作用24 h 后全量换液。以后每隔 3 天半量换液一次。
收起
注意事项
1. 上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 dna 酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。
2. 上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择孕13 d 左右的小鼠。
3. 神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够。
4. 在玻片上培养神经元时，一定要注意玻片的来源和处理方法，这个非常重要，对神经细胞的影响 是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话，那么您在以后的培养中还是用同 一来源(厂家)的玻片。
5. 如果有b27 和neurobasal 培养基，那么就方便了(不用加 arac):
(1)把细胞悬液用(dmem＋20%fbs)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成 2% b27 的 neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
(2)把细胞悬液用直接用 2% b27 的 neurobasal 培养基悬浮接种。
(3)可以用新生1 d 内的胎鼠皮层直接培养。
酶消化法
实验材料 小鼠
试剂、试剂盒 酒精解剖液胰蛋白酶dmem f12b27阿糖胞苷培养液
仪器、耗材 培养箱
实验步骤
一、小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤
1. 于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠脑。
2. 预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块。
3. 移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培养箱中消化30 min。
4. 将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液。
5. 最后再用接种液1 ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用。
6. 加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块。
7. 收集含单细胞悬液的上清液约4-5 ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中。
8. 培养24 h至细胞贴壁后，换全培养液（dmem/f12+2%b27）培养3d，观察神经元生长状况。
9. 换用阿糖胞苷培养液、 每隔3d换全培养液1次，每次换半液。
二、神经元免疫化学鉴定
1. 4%多聚甲醛固定细胞30 min，pbs洗涤3次。
2. 加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30 min，pbs洗涤3次。
3. 加入5%羊血清封闭20 min，弃去多余液体。
4. 加入rabbit anti-nse（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4 h，pbs洗涤3次。
6. 加入dapi染液（1:40），室温放置5-10 min；pbs洗涤3次。
7. 荧光显微镜观察。
三、结果
图1： 刚接种时细胞图
图2： 刚接种时细胞图培养1d后
图3： 刚接种时细胞图培养2d后
图4： 刚接种时细胞图培养3d后
图5： 刚接种时细胞图培养4d后
图6： 刚接种时细胞图培养5d后
图7： 刚接种时细胞图培养6d后
图8：第7d免疫鉴定图