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细胞周期测定BrdU渗入法

2024-2-27 18:29:46发布次查看发布人:

实验方法原理
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。
brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞dna复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含brdu的dna将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。
实验材料 细胞
试剂、试剂盒 brdu甲醇冰醋酸giemsa染液秋水仙素ssc柠檬酸三钠nacl
仪器、耗材 冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜
实验步骤
一、试剂配制
1.  brdu配制
brdu 10 mg加双蒸水10 ml ,4℃下避光保存。
2.  2xssc配制
nacl 1.75 g,柠檬酸三钠0.88 g,加水至100 ml,4℃保存。
二、细胞生长至指数期时,向培养液中加入brdu,使最终浓度为10 ug/ml。
三、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1 ug。
四、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
五、常规染色体制片。
六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2xssc 液,距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。
七、弃去2xssc液,流水冲洗。
八、giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。
九、镜检100个分裂相,计一、二、三、四细胞期分裂指数。
十、计算
细胞周期(tc)=48/{(m1+2m2+3m3+4m4)/100}(小时)
收起 
其他
一、细胞周期介绍
细胞周期(cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,分为间期与分裂期两个阶段 。
1.  间期
间期又分为三期、即dna合成前期(g1期)、dna合成期(s期)与dna合成后期(g2期)。
(1)g1期
此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后,分化并执行各自功能,此g1期的早期阶段特称g0期。在g1期的晚期阶段,细胞开始为下一次分裂合成dna所需的前体物质、能量和酶类等。
(2)s期
s期是细胞周期的关键时刻,dna经过复制而含量增加一倍,使体细胞成为4倍体,每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时,还合成组蛋白,进行中心粒复制。s期一般需几个小时。
(3)g2期
为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕,形成两个中心体,还合成rna和微管蛋白等。g2期比较恒定,需用1~1.5小时。
2.  分裂期
细胞的有丝分裂(mitosis)需经前、中、后,末期,是一个连续变化过程,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1~2小时。
(1).前期(prophase)染色质丝高度螺旋化,逐渐形成染色体(chromosome)。染色体短而粗,强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动,在细胞中形成两极;而后以中心粒随体为起始点开始合成微管,形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化,核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。
(2)中期(metaphase)细胞变为球形,核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面,从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群,共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46,xy,女性为46xx。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状,均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。
(3)后期(anaphase)由于纺锤体微管的活动,着丝点纵裂,每一染色体的两个染色单体分开,并向相反方向移动,接近各自的中心体,染色单体遂分为两组。与此同时,细胞波拉长,并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动,该部缩窄,细胞遂呈哑铃形。
(4)末期(telophase)染色单体逐渐解螺旋,重新出现染色质丝与核仁;内质网囊泡组合为核被膜;组胞赤道部缩窄加深,最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。
在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类:
①增殖细胞群,如造血干细胞,表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力,连续进入细胞周期循环。
②不再增殖细胞群,如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞,它们丧失了分裂能力,又称终末细胞(end cell)。
③暂不增殖细胞群,如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的,并执行特定功能的细胞,在通常情况下处于g0期,故又称g0期细胞。在某种刺激下,这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后,剩余的肝细胞迅速分裂。

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