pod辣根过氧化物酶的溶解性及分类说明 说 明：pod是一种具有氧化还原酶性质的血红素蛋白。用于生化研究，是酶标记法所用的一种主要酶。也用于生物液体中葡萄糖和半乳糖的测定。别 名：donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase；horseradish peroxidase；hrp
cas ：9003-99-0
外 观：棕褐色结晶或冻干粉
类 型：type vi-a
酶 活：250-330 u/mg 固体
溶解性：溶于0.1 m 磷酸盐缓冲液, ph 6.0，参考浓度10mg/ml
hrp是一种分子量达44 000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，中性糖和氨基糖约占18％，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一个hrp分子中含一个氯化血红素ix作辅基，该辅基在403nm波长处有最大吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有最大吸收。hrp在403nm的od值与275nm的od值之比，也就是所谓的rz(reinheits zahl)值。rz值仅说明血红素基团在hrp中的含量，并非表示hrp制剂的真正纯度，而且rz值高的hrp制剂，并不意味着酶活性也高。但可以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1％(w/v)酶溶液吸光度为22.5，浓度为227umol/l]。纯辣根过氧化物酶干燥贮存于–20oc可保持稳定，使用1.36 mol/l甘油、10mmol/l磷酸钠、30umol/l牛血清白蛋白和20umol/l细胞色素c(ph 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。hrp对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0％甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。硫化物在10–5～10–6mol/l浓度时具有可逆性地抑制hrp的作用；氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol／l浓度时抑制hrp；hrp还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。强酸也是hrp的强烈的抑制剂。
因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。hrp的同工酶主要可分为三种类型：①含糖量高的酸性同工酶。②等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。③含糖量低的碱性(pi>11)同工酶。酶免疫试验中所使用的hrp，以pi为8.7～9.0的所谓“c”同工酶为主要组成成分，其他同工酶的活性则很低。“c”同工酶的共价结构由2个密切接近的区域组成，血红素基团则位于其间而成夹心结构，糖链以8个不同的部位结合于多肽。天然的酶所带的纯电荷极少；无游离的。—氨基，仅有2个可测出的组氨酸，6个赖氨酸似乎全被糖链外壳所遮盖。因此，hrp一般仅有1～2个可用于耦联的氨基。
根据hrp的催化特性，elisa中一般使用过氧化氢(h2o2)作为hrp底物之一，在供氢体(即色原底物)存在时，hrp与h2o2的反应迅速而又专一。由图4可见，hrp被h2o2二价地氧化形成复合物i，而复合物i又可与氢供体的二步连续的单价相互作用而还原至起始状态。复合物ⅱ是被氧化的带一个电子的中间产物，当h2o2过量，由于复合物ⅲ或ⅳ的形成，酶活性受抑制(以后补上)。30％的h2o2并不稳定。由于h2o2既为hrp的底物，也为其抑制剂，因而elisa要想得到满意的测定结果，h2o2必须限定在一定的浓度范围内，终浓度通常为2～6 mmol/l。然而在实际研究工作中，一般很少注意这一点。大多数研究者所使用的h2o2的浓度常较理想反应所需的量大2～4倍。吸附于固相的hrp较游离的hrp更易受过量h2o2的抑制。如果30％h2o2贮存液浓度经测定证实确为30％，则稀释10 000—12 000倍常是较为理想的底物。h2o2的摩尔消光系数为10mm光径240nm波长下为43.6，因此，可通过这种方式来检测h2o2工作溶液的浓度。
固相elisa中，当温度高于20oc时，hrp活性常较低，在底物溶液中加入非离子去垢剂聚山梨醇-20或tritonx-100可延迟hrp的失活，且可使反应温度加大，但非离子去垢剂的这种酶活性保护效应依氢供体的不同而有差异。如以2,2’-联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸(abts)为氢供体，则只能保护20％的酶活性，而以邻联茴香胺(oda)为氢供体时，酶活性的保护提高至90％。
hrp之所以是迄今为止在elisa中应用最为广泛的标记用酶，主要是因为其一方面易于提取，价格相对低廉；另一方面性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。
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