货号：yj1174                                     规格：100管/48样
ca++ mg++-atp 酶活性测定说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
ca++ mg++-atp 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化atp水解生成adp和无机磷。
测定原理：
根据ca++ mg++ -atp 酶分解atp生成adp及无机磷，通过测定无机磷的量来确定atp酶活性高低。
需自备的仪器及用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100ml×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10ml×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入6ml蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂三：液体 2ml×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入3ml蒸馏水， 4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂六：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25ml蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂七：液体25ml×1 瓶，室温保存。
试剂八：10mmol/l 标准磷贮备液 10ml×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/ml标准磷应用液配制：将试剂八20倍稀释，即取0.1ml试剂八加1.9ml蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按 h2o: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 ep 管中加入下列试剂）
对照管
测定管
试剂一（μl）
65
45
试剂二（μl）
60
60
试剂三（μl）
 
20
样本 （μl）
 
100
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min
试剂四（μl）
25
25
样本 （μl）
100
 
混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液
3、定磷（在 ep 管或 96 孔板中加入下列试剂）
空白管
标准管
对照管
测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μl）
 
20
 
 
上清液（μl）
 
 
20
20
蒸馏水（μl）
20
 
 
 
定磷试剂（μl）
200
200
200
200
混匀，室温放置30min，在660nm处，记录各管吸光值。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管只能测48份 ca++ mg++-atp酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是
检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
ca++ mg++-atpase 活力的计算：
1、血清（浆）ca++ mg++-atpase 活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中ca++ mg++-atp酶分解atp产1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
ca++ mg++-atp 酶活力（μmol/h/ml）= [c 标准管×v 总]×（a 测定管-a 对照管）÷（a 标准管-a 空白管）÷v 样÷t=7.5×（a 测定管-a 对照管）÷（a 标准管-a 空白管）
2、组织、细菌或细胞中ca++ mg++-atpase 活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中ca++ mg++-atp酶分解atp产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
ca++ mg++-atp酶活力(μmol/h/mg prot)= [c标准管×v总]×（a测定管-a对照管）÷（a 标准管-a空白管）÷（v样×cpr）÷t =7.5×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中ca++ mg++-atp酶分解atp产生1μmol无机磷的量为一个酶活力
单位。
ca++ mg++-atp酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[c标准管×v总]×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷(w× v样÷v样总)÷t=7.5×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）÷w
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中ca++ mg++-atp酶分解atp产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
ca++ mg++-atp酶活力(μmol/h /104cell)= [c标准管×v总]×（a测定管-a对照管）÷（a 标准管-a空白管）÷(500×v样÷v样总)÷t=0.015×（a测定管-a对照管）÷（a标准管-a空白管）
c 标准管：标准管浓度，0.5μmol/ml；v 总：酶促反应总体积，0.25ml；v 样：加入样本体
积，0.1ml ；v 样总：加入提取液体积，1ml；t：反应时间，1/6 小时；cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；w：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
293t细胞培养说明书
人甲状腺癌细胞（b-cpap）培养说明书
高纯度质粒小量快速提取试剂盒说明书