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2结果与讨论
2.1不同添加剂青贮饲料现场评定指标
图1表示全株玉米和青玉米秸青贮饲料的感官指标、原料水分及ph值的综合评定结果。可以看出,经各添加剂处理后得到的全株玉米青贮饲料评定得分均高于75,为优等青贮饲料,青玉米秸青贮饲料均为良好青贮饲料,且评定得分均在对照组的基础上有所提高。因此,乳酸菌和酶制剂的添加都可以改善玉米青贮饲料的色泽、气味和质地,提高其发酵品质,其中乳酸菌1和酶制剂1的共同作用效果明显优于单独作用,而且亦优于乳酸菌2+酶制剂2处理组。
2.2不同添加剂青贮饲料实验室评定指标
1)有机酸含量及组成
有机酸总量及其构成可以反映青贮发酵过程的坏,其中最重要的是乳酸、乙酸和丁酸,表3即是它们自的含量、与总酸的比值以及基于flieg法的评定果。
由表3可得,各处理组青贮饲料很少或未产生丁酸。两个对照组青贮饲料的有机酸评定结果都较好,说明试验所用的两种原料中含有足够青贮发酵的乳酸菌和糖分,酶制剂1和乳酸菌2+酶制剂2两组添加剂的加入也较好地保证了处理组青贮饲料中乳酸的发酵品质。而乳酸菌1和乳酸菌1+酶制剂1处理组中,全株玉米青贮饲料的乳酸占总酸比例分别比对照组低34%、36%,青玉米秸青贮饲料相应低25%、36%,乙酸占总酸的比例则成倍增加,明显高于对照组,这表明乳酸菌1的添加使青贮饲料中的乳酸菌以异型发酵为主,产生乳酸的同时亦产生了大量乙酸和乙醇,由于各处理组的总酸含量之间无显著差异(p>0.05),所以一定程度上抑制了乳酸的产生,降低了乳酸的发酵品质。
2)纤维素成分含量
各处理组青贮饲料的纤维素成分含量如表4所示。
分析表4数据可得,添加乳酸菌1使全株玉米和青玉米秸青贮饲料中的中性洗涤纤维(ndf)和酸性洗涤纤维(adf)含量均有所增加,这可能是因为乳酸菌促使了一些细胞壁物质的的降解,从而使ndf、adf等不可消化组分的含量相对增加。而与对照组相比,乳酸菌制剂和酶制剂的混合作用则显著降低了纤维素的含量(p<0.05),如乳酸菌1+酶制剂1使全株玉米和青玉米秸青贮饲料的ndf含量分别降低7%和5%,adf含量相应降低10%、6%,这说明只有乳酸菌和酶制剂共同作用时,才能有效地降低ndf、adf的含量,提高青贮饲料的营养价值。酶制剂1处理组青贮饲料的ndf、adf含量和对照之间、各处理组之间的酸性洗涤木质素(adl)含量差异均不显著(p>0.05)。3)粗蛋白及氨态氮与总氮比值青贮饲料的粗蛋白、氨态氮含量,以及依照氨态氮与总氮(总氮(%fm)=粗蛋白(%fm)/6.25)比值的评定得分见表5。
氨态氮与总氮的比值反映了青贮饲料中蛋白质和氨基酸分解的程度,由表5可以看出,本试验中全株玉米青贮饲料的氨态氮与总氮比值的评定得分均为满分50分,青贮质量优良[5]。而酶制剂1和乳酸菌1+酶制剂1却使青玉米秸青贮饲料的氨态氮与总氮比值分别比对照增加35%、24%,由于检测到此两处理的青贮桶有一定量的流出液,并且两处理组青贮饲料中均检测到了少量的丁酸,分析原因可能是潮湿的条件促使了一些梭菌的生长,从而一定程度上加大了蛋白质水解。所选乳酸菌制剂和酶制剂对全株玉米和青玉米秸青贮饲料中粗蛋白含量都无显著影响(p>0.05)。
2.3不同添加剂青贮饲料生物评定指标
青贮饲料的动物消化指标:干物质消失率和ndf瘤胃降解率如表6所示。
方差分析可知,不同添加剂处理后青贮饲料的干物质消失率均明显高于对照组(p<0.05),其中乳酸菌1+酶制剂1和乳酸菌2+酶制剂2作用效果最显著,并同时使全株玉米和青玉米秸青贮饲料的ndf瘤胃降解率亦明显高于对照组,而其他处理组的ndf瘤胃降解率与对照组之间无显著差异(p>0.05)。酶制剂1虽然对降低青贮饲料的纤维素含量未达到显著性效果,乳酸菌1甚至使纤维素含量高于对照组,但它们都提高了干物质消失率,促进了动物对青贮饲料的消化。
2.4不同添加剂抑制青贮饲料二次发酵的效果
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牧草的青贮是利用微生物的发酵作用，长期保存青绿饲料营养的一种简单、经济而可靠的方法，是保证家畜长年均衡供应粗饲料的有效措施。我国在元代《王桢农书》等书中就有苜蓿青贮发酵方法的记载。青贮现在已成为畜牧业中的一项重要技术。牧草不仅可以用调制干草的方式贮藏，也可用青贮的方式进行贮藏。青贮可减少营养物质的损失，如果青贮设施先进，技术操作合适，营养的损失一般不超过15%，并保持青草中90%以上的胡萝卜素。青贮料可以提高家畜的适口性和消化率，经微生物发酵后的青贮牧草具有酸香味，柔软多汁，适口性好，能刺激家畜的食欲，加之乳酸对肠胃的刺激作用使消化率明显提高，青贮可使牧草长期保持在青鲜状态，富含蛋白质、多种维生素和矿物质，能长年为家畜提供高营养价值的饲料。青贮的制作过程不受气候条件的限制，阴雨季节或天气不好，难以调制干草时，制作青贮影响较小。牧草青贮的原理，青贮是利用牧草表面所附着的乳酸菌等，为它们的生长繁殖创造有利的条件(厌氧环境)进行生命活动，通过微生物的厌氧呼吸，将青贮牧草原料中的可溶性碳水化合物，主要为蔗糖、葡萄糖和果糖转化为乳酸为主的有机酸，在青贮料中积聚起来，当有机酸积累到0.65%～1.30％(优者可达1.5%～2.0%)或当ph值降到4.2～4.0以下时就抑制了腐败菌、丁酸菌等大部分有害微生物的活动，由于乳酸不断的积累，随着酸度的增加，最终乳酸菌本身也受到抑制而停止活动，使青贮料得以长期保存。f61e537c402946c8b37627f8aa661d76
3 乳酸菌青贮秸秆的研究趋势
近年来随着分子生物学的飞速发展和对乳酸菌研究的进一步深入，为人们提供了一个采用基因重组技术把外源纤维素酶的基因导入乳酸菌中的途径。应用这种构建的工程乳酸菌可以省去纤维素酶的生产和添加这一步骤，节约成本，因而，近年来，国内外利用乳酸菌表达外源纤维素酶基因的报道越来越多。franca rossi等（2001）将枯草芽孢杆菌的cela基因连接到大肠杆菌-植物乳杆菌穿梭载体pgip73上，然后转化植物乳杆菌l.plantarum lp80和l.plantarum b41。结果目的蛋白产生了43～59u/l的酶活。liu等（2005）将瘤胃分解纤维素菌fibrobacter succinogenes的β-葡聚糖酶基因和neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因xyncdbfv以及piromyces rhizinflata的纤维素酶基因egla分别连接到表达载体pnz3004上，电转化乳杆菌l.reuteri pg4，检测到了目的基因表达。bates eem （1989）、j s cho （2000）等先后将内切葡聚糖酶基因从芽抱杆菌中克隆并分别在植物乳杆菌lactobacillus plantarum、溶血乳杆菌lactobacillus johnsonii及乳酸杆菌lactobacillus gasseri中表达；heng nck（1997）等将浸麻芽饱杆菌bacillus macerans来源的内切葡聚糖酶基因在瑞士乳杆菌lactobacillus reuteri中表达。赵莹（2008）将能降解纤维素酶系中的葡萄糖外切酶cbh11基因在非抗生素抗性表达载体（pw425t）进行重组后，将其在乳酸杆菌中进行表达并对其活性检测，结果显示，转酸性纤维素酶基因工程乳酸菌具有分泌酸性纤维素酶的功能。其中，从真菌中分离的纤维素酶可以在青贮过程中起到良好的效果。这些酶可以有效地水解其中的结构多糖，产生更多的被产酸菌株直接利用的原料物质—单糖。史瑞（2010）将来自瑞氏木酶属的纤维素酶基因cbhⅱ与表达载体pet30a重组，构建了重组质粒petcbh。将重组质粒转化rosetta宿主菌，获得了重组菌株rosetta（petcbh）；利用iptg诱导重组菌株rosetta（petcbh），并通过pnpc法测定了重组纤维素酶cbhⅱ的活性，其活性为2.677u/ml。并建立了一种新的real-time rt-pcr分析方法，同时利用pnpc法测定了工程菌的酶活力，为构建青贮用转纤维素酶基因乳酸菌提供了一种技术路线和对其进行相关指标评价的方法。山东大学孙磊（2005）用来自枯草芽抱杆菌y-106的纤维素酶基因连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pmg36e上，电转化导入乳酸乳球菌mg1614，携带的纤维素酶基因在乳酸乳球菌中表达并有活性，其胞外酶活为0.133u/ml。
随着转基因生物技术的发展及研究水平的不断提高，通过对乳酸菌的育种和生物学特性的认识的不断深入和对纤维素酶基因的筛选及克隆的研究，将能得到更为优良的青贮乳酸菌基因工程菌，将会大大提高秸秆青贮的效果。
4 小结
利用乳酸菌青贮秸秆一直是国内外研究的焦点，但由于菌种及来源、使用剂量不同，作用的秸秆也不相同，所取得的结果也不一样。用乳酸菌和纤维素酶联合发酵秸秆取得了较好的效果，应用分子生物学技术，将纤维素酶基因转入乳酸菌中，将是乳酸菌青贮秸秆的研究重点和趋势。
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鲜玉米秸秆青贮饲料的制作。将制种玉米父本用揉丝机揉搓成2～3cm长草丝，逐层装填，逐层喷洒青贮乳酸菌液，逐层踏实，每层约15～20cm厚，直至贮料超出窖口60cm左右，踩实后用塑料薄膜将贮料盖严，四周用湿土将塑料薄膜压实封严。
干玉米秸秆微贮饲料的制作。将无霉变的自然风干的干玉米秸秆，用揉丝机揉成2～3cm，然后选用乐贝丰牌秸秆发酵剂，秸秆(kg)、菌种(g)、食盐(g)、水(ml)按照1000∶3∶7∶800～1000的用量比例配制菌剂。然后将贮料逐层填装，逐层喷洒菌剂和清水(每吨干秸秆添加清水约110kg～120kg)，逐层压实，每层约20～30cm厚，如此反复直到高出窖顶50～60cm， 在最上面均匀洒上食盐(食盐的用量为每平方米250克)，压实后再盖上塑料薄膜，薄膜上面覆土15~20厘米后密封。
干玉米秸秆黄贮饲料的制作。将无霉变的自然风干的干玉米秸秆用揉丝机揉成2～3cm长，然后每吨干秸秆添加清水约110kg～120kg，使秸秆含水量保持在65%左右，即用手握紧贮料，以指缝有水珠但不滴水为宜，再逐层装填，同时逐层加入添加剂(每吨秸秆添加尿素30kg、食盐2.5kg)，逐层压实，直至贮料高出窖口60cm后堆土30cm封窖。fdb15288a57d4b4fbfbc0c58d215606e
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