本人具有数年的细胞培养经验，期间经历了无数次的失败和成功，回想起来有苦也有甜，现在把中国疾病预防控制中心和我自己的经验结合起来，制作成mdck细胞培养sop，欢迎大家参阅：
一、目的
mdck细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。
二、适用范围
适用于疾控中心所有技术人员 。
三、程序
（一）生物安全要求
实验室生物安全级别：bsl-1
所有操作必须在bsl-1实验室的生物安全柜里进行。
（二）材料
1. 生长成片的mdck细胞
2. 无菌的t25细胞培养瓶
3. d-mem培养液（含有l-谷氨酰胺）
4. 青、链霉素母液（10000 u/ml青霉素g；10000µg/ml硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
5. hepes缓冲液，1m母液
6. 胎牛血清
7. edta-胰酶（0.05%胰酶，0.53mm edta-4na），分装后保存于-20℃
8. 7.5%牛血清白蛋白组分v
9. 1ml、10ml无菌移液管
10. 70％～75％的酒精
注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
（三）实验步骤
这里以t75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述mdck细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，mdck细胞悬液的量必须做相应的调整。
1. d-mem培养液的准备
500ml d-mem液中加入：
青、链霉素母液5ml（终浓度达：100u/ml青霉素；100µg/ml链霉素），
hepes缓冲液12.5ml（终浓度：25mm）。
7.5%牛血清白蛋白组分ⅴ 12.5ml
2. 细胞生长液的准备
胎牛血清10ml加到90ml的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5ml在37℃水浴中预热的edta-胰酶。
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使edta-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去edta胰酶。
5. 重新加入5ml在37℃水浴中预热的edta-胰酶重复上述步骤。
6. 加入1mledta-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1ml胎牛血清灭活残余的胰酶。
7. 加9ml已经配置好的含有l-谷氨酸的d-mem培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
8. 取10ml混合物加到90ml细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）
9. 每个t25细胞培养瓶加入6ml（6×105/ml）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到t75细胞瓶用于细胞传代。通常6ml细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
10. 于37℃，5%co2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。

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