基于树枝状聚合物构建的核酸载体研究进展
树枝状聚合物(dendritic ploymers, dendrimer)由于其独特的结构和物理化学性质在聚合物学科领域引起人们广泛关注, 并在最近40多年蓬勃发展.树枝状聚合物是继线形、支链形和交联聚合物以后新发展的第四类聚合物, 包括树枝分子(dendrimer)和超支化聚合物(hyperbranched polymer).树枝形聚合物具有精确的纳米构造, 其精确的层数与体积可由合成步骤决定.此类聚合物一般通过ab2, a2+b, a2+b'b2, 自缩合乙烯基聚合(scvp)及自由基聚合等方法共价合成.树枝形分子是通过缩聚反应得到的, 需严格控制反应过程使其结构具有极好的对称性, 从而得到完美状态的树枝状结构的分子.但这类树枝状化合物的制备和纯化具有一定的困难, 因而限制了其广泛的发展应用.超支化聚合物的结构不要求很完美, 具有一定的相对分子质量分布, 并且与树枝形分子相似, 一般可采用一锅法来合成, 所以易于产业化生产.最近部分研究者已经开始通过超分子化学的方法来合成具有不同拓扑结构的树枝状聚合物, 这类聚合物由于具有无尺寸限制、可大量生产且重复性好、价格低、使用简单方便、易于修饰等优点而受到广泛关注.自20世纪80年代以来, 树枝状聚合物的合成方法由最初的发散法发展出收敛法、发散收敛共用法以及固相合成法等多种合成方法.
非病毒载体包括树枝状聚合物、多肽类、多糖类、脂质体、阳离子聚合物和无机纳米颗粒.它们由于安全、易于制备、成本低而被广泛应用.早期的病毒类基因载体存在较多缺陷如转载能力小、耐反复感染、难以进行生产和质量控制以及安全性低等.而非病毒基因治疗的出现, 可以克服病毒载体的种种限制.但是很多非病毒基因载体自身的生物毒性和低的生物降解性阻碍了它们的发展.因此缺乏高效低毒的基因运送载体成为基因治疗的主要障碍.大多数的阳离子树枝状聚合物包括聚赖氨酸和聚乙烯亚胺, 虽然能够获得较高的转载率, 但是却难以避免地对细胞产生较大的毒性, 使得其临床应用受阻.
基因治疗是指将外源性的dna, rna用于治疗后天获得性疾病, 该方法已经被广泛应用于临床试验.基因治疗是公认的用于治疗后天以及先天性疾病(如艾滋病、癌症、基因紊乱等疾病)具发展潜力的治疗方法.在基因治疗中只有一个问题需要解决:基因的输送.输送基因的载体可分为病毒和非病毒载体.病毒载体由于破坏其自身自然的感染体系易引起变异, 尽管事例证明它很有效, 但是其存在的安全隐患即免疫原性以及可能的基因重组等都限制了其应用.
树枝状聚合物具有得天独厚的分子特征(三维立体结构)和物理化学性质, 因此被广泛地应用于构建多种聚合物材料、纳米药物、生物材料等.特别是在抗癌基因载体中起到很好的抗癌治疗效果, 表现在与dna/ rna分子的偶联及与抗癌药物分子的结合.树枝状聚合物可以通过修饰得到不同功能响应型树枝状聚合物基因载体, 并可以和多种有机大分子、无机材料复合形成多功能基因载体.该类分子所形成的基因载体也逐渐成为非病毒载体中的重要成员.本文以四个章节分别介绍了树枝状聚合物材料、有机无机化合物结合的载体材料、超分子母体材料结合的载体材料和功能响应性载体等材料.
1 树枝状及其衍生材料与pei超支化分子相同, pamam树枝高分子不仅可以转载基因, 并且氨基官能团可以结合药物分子组成嵌段化合物, 此外其本身也具有荧光.但该大分子的生物毒性限制了其在药物基因转载上的应用. pamam树枝状高分子通过共轭萘酰亚胺基团的取代反应进行改性, 如它结合壳聚糖(cts)后主链共轭物的水溶性增加, 并且可与质粒dna复合形成球形颗粒. cts-pamam的共轭/质粒dna复合物的转染效率明显高于未改性的壳聚糖和pei, 同时具有较低的n/p(树枝状分子中的一级胺和二级胺/dna或者rna中的磷酸比值).同时研究人员对合成的cts-pamam复合物进行dna的络合, 体外细胞毒性, 体外转染hela细胞(子宫颈癌细胞)和血液相容性进行了研究.结果表明, 壳聚糖改性后的树枝状共轭物即使在高浓度(300 mg/ml)也表现出优异的dna复合性, 低毒性以及血液相容性.后期他们发现n-酰化壳聚糖修饰的pamam也表现较好的转染.因此壳聚糖分子的共轭树枝状分子cts-pamam可用作安全的非病毒基因载体.
官能团的修饰同样可以增加pei基因载体的靶向性, li等报道的含功能性官能团的pei实现了基因的定向转载.他们利用经油酸修饰的吐温85, 经过琥珀酸酐开环形成羧基化吐温85, 然后将其与低分子量pei(分子量为2000)缩合形成两亲性的二元复合大分子, 该复合物与pdna自组装形成新型基因载体tp.小分子pei的毒性较低, 并具有较高的转载效率.脂质层的存在为正电荷的pei-dna复合物的内核提供了一个电荷屏蔽外延.实验表明, tp是安全有效的基因载体, 特别是在大量表达的低密度脂蛋白受体细胞中的使用, 如ht29-dx细胞(人结肠癌细胞株)、a549的dx细胞(肺癌细胞系)及hepg2细胞(肝癌组织)等.
阳离子聚合物/dna复合物很容易在人血清中沉降, 被各种生物酶分解, 如何提高其血清的抵抗力、生物可降解性以及无毒转染机制备受科学家关注. zhang等合成了以ppi二代树枝高分子为核心的mp-g-ppi多臂基因载体(图 6).作者利用内核ppi上的氨基修饰上聚(l-谷氨酸)(plg)后, 再接枝低代ppi (g1.0或g2.0)形成环绕式多臂支链.由于plg支臂可生物降解且毒性低, 而且ppi球状结构外围的小分子ppi可以很好地保护压缩dna, 因此应用其转染dna进行基因治疗也取得了很好的效果.该类载体的电势(zeta potentials)可达到42～44 mv, 这种聚合物能够与质粒dna复合从而得到稳定的带正电荷的粒径为111～219 nm的纳米颗粒.用透射电子显微镜(tem)可观察到mp-g1.0 ppi/ pdna相互作用形成的球形颗粒状复合物.对比不同分子量和不同pei载体结构的转染sirna基因治疗, 结果表明其达到了lipofectamine 2000 (l2k)同等的效果.
利用天然氨基酸作为树枝状分子的单体不仅充分了利用天然氨基酸的优点, 并且合成的树枝状载体毒副作用小. helena等报道了树枝状聚酰胺-胺(pamam)结合rgd短肽arg-gly-asp(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的新型基因载体.聚酰胺-胺六代树枝状分子经修饰后可控制结合上4个、8个、16个多肽单元(图 11). rgd多肽在细胞表面作为纤维连接蛋白受体可以提高基因转载效率.实验证明质粒dna可以通过rgd中间介导与细胞表面的负电荷发生非特异性静电反应进入骨髓间充质干细胞. khuloud等利用新型第六代阳离子水溶性聚l-赖氨酸树枝状化大分子poly(l-ly-sine)(分子量8149000)与疏水性化疗药物阿霉素络合, 增加了亲脂性抗癌类药物的渗透性和转载效率.而且这个复合物在单层细胞组织、多细胞肿瘤球体(mts)以及活体肿瘤细胞里都展现了比单独抗癌药更好的渗透性.总的来说, 利用抗血管增生的超支化聚合物基因载体可以提供一个合理的抗血管生成和肿瘤体内化疗的组合疗法.
由于硅原子的特殊性质, 与其他的树枝状高分子相比, 含硅的树枝状高分子具有显著的多样性, 同时具有含硅化合物的许多优异性能, 如低的玻璃化温度、低的表面能等.根据不同的生物应用, 可将适当的官能团键接于有机硅树枝状高分子上, 赋予了树枝状高分子新的功能.研究表明碳硅烷超支化分子可以很好地转载释放寡核苷酸(odns)与小片段干扰核糖核酸(sirna). martínez等利用酞酰亚胺为起始原料合成了不同支化代数的碳硅烷树枝高分子, 并且在大分子外围进行氨基甲基化修饰(图 8).研究表明树枝状化合物表面带有正电荷的氨基或季铵盐具有抗菌活性.然后将合成的阳离子三代碳硅烷超支化分子修饰在介孔二氧化硅(msns)上, 并且可以利用二氧化硅的孔径吸附相关药物分子.该类基因载体在转染odns过程中不影响细胞存活率, 生物毒性很小.实验表明, 其在人骨肉瘤细胞(hos cell)的24 h内dna转载率可达到84%, 成功取得了临床基因治疗效果.
polyethyleneimine (pei)是一类典型的基因载体, 它被广泛应用于脱氧核糖核酸(dna)、小片段干扰核糖核酸(sirna)以及反式寡聚脱氧核苷酸(odn)的转导, 并表现出极高的转导效率. pei的正电荷起到质子海绵体的作用并且对dna有较好的保护.但同时也因为其内在的生物毒性、与体内细胞组织、血液细胞中没有特定靶向性, 并且在血清蛋白中会自聚合, 从而限制了其在生物体内的应用.为了提高pei的生物靶向性降低其生物毒性, 科学家将pei与多种分子(脂质体、聚合物、生物活性分子等)结合.引入靶向分子可以有效提高基因的靶向传递, 实现靶向细胞的选择性转染. carsten等报道的超支化pei自组装的二元或三元复合物(比如pei-pdna-ins)可以提高肺泡上皮细胞的基因传递和表达(图 2).他们利用超支化pei与质粒脱氧核糖核酸自组装成复合物粒子, 将人胰岛素(ins)以非共价键吸附在二元复合物纳米粒子上, 由于肺泡支气管上皮细胞中胰岛素受体较多, 从而达到定向转载基因并且增加基因表达的目的; 同时胰岛素包覆后可以降低三元复合物的生物毒性.由此自组装形成的三元pei-pdna-ins目标复合物为肺泡上皮细胞的后天获得性和遗传肺部疾病提供了新疗法.
超支化聚合物与树枝高分子相同, 具有丰富的末端官能团、三维空间结构和分子内部空穴结构, 并且在基因转染方面展现着优异的性能.但它在合成和纯化方面有着显著的优势, 如制备简单、可规模化生产. wang等报道了超支化聚酰胺胺(paas)应用于基因输送体系.作者通过一锅法迈克尔加成聚合, 以n, n'-亚甲基双丙烯酰胺和1-(2-胺乙基)piperazine为反应单体, 通过控制反应液h2o/dmf的比例得到了支化度为0.06～0.44、数均分子量为8300～9320的超支化聚酰胺(图 3).通过对超支化高分子支化度的控制而调整其质子缓冲能力、生物毒性以及压缩pdna的能力.实验结果显示聚合物/质粒dna的复合物可以高效进入细胞, 并且聚合物载体在转染过程中停留在细胞质内.后期他们利用n, n'-双(丙稀酰)胱胺代替单体n, n'-亚甲基双丙烯酰胺合成了氧化还原响应型的超支化基因载体.
利用天然氨基酸组成的多肽同样可用于基因载体, 并且多肽倍广泛应用于在特定组织及细胞内的基因靶向/定向转导. bayele等合成了以疏水性脂肽为核心, 外围修饰带正电荷赖氨酸的双功能超支化分子非病毒基因载体.脂肽结构的独特性、合成可控性和特异性以及它们的多功能性和广泛的修饰性, 使他们成为新的一类超支化高分子基因载体.该小组对脂肽的末端赖氨酸进行修饰, 从而形成内核疏水外围亲水的超支化载体.实验表明, 肽的超支化分子可以在体外干扰荧光酶的rna的表达.同时在肽基础上将超支化高分子与抗癌药物结合, 可以增加抗癌脂溶性药物在体内的吸收.
近年来基于阳离子聚合物的非病毒转基因载体已经取得了备受瞩目的进展.多种阳离子树枝状聚合物分子被应用于基因转载的研究中, 本文主要侧重于介绍支化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, pei)、超支化聚酰胺胺[poly(amido amine)s, paas)]、聚酰胺-胺型树枝状高分子(polyamidoamine, pamam)、聚l-赖氨酸树枝状化大分子[poly(l-lysine), pll]、聚(醚亚胺)树枝状高分子(petim)、聚丙烯胺树枝状高分子(polypropyleneimine, ppi)、三嗪类树枝高分子(triazine dendrimers)、碳硅烷树枝状高分子(carbosilane dendrimers)、磷化树枝高分子(phosphorus dendrimers)、紫精树枝高分子(viologen dendrimers, vgd)以及基于氨基酸及其多肽构建的树枝状聚合物.此类聚合物拥有特殊的结构及纳米尺寸, 并且在外围有大量的官能修饰位点.该类聚合物结构具有丰富的可修饰功能基团, 提供载体的功能化和智能化修饰的可能, 因此被应用于基因载体材料.利用树枝状聚合物的大量外围官能团进行改性, 构建优良性状的阳离子聚合物, 实现基因分子的转载.氨基载量高的正电荷树枝高分子与脱氧核糖核酸/核糖核酸的磷酸基负离子结合, 将伸展的双链dna/rna分子压缩成纳米小球.此种复合可以保护dna/rna分子在细胞内的分解, 利于细胞内吞及其基因的释放(图 1).
紫精(n-取代的4, 4'-联吡啶季铵盐)具有优良的氧化还原可逆性及特殊的光电化学性能, 因此在光电转换、光致变色、电致变色材料等方面有广泛的应用. li等合成了一系列的紫精树枝高分子(vgd), 分别利用甲基、乙基以及胸腺嘧啶修饰, 并且对这些vcd在基因转染上的进行研究(图 10).实验表明增加紫精树枝分子重量和正电荷的数量可以提高dna转染效率和cxcr4拮抗作用, 然而, 较高的分子量同时也增加了细胞毒性.因此, 实验表明低支化代的vgd (g1, g2)拥有作为趋化因子受体(cxcr4)拮抗剂和基因载体双重功能.这种双功能基因载体在cxcr4基因治疗中有突出的效果, 适用于包括癌症转移、hiv感染和多种炎性疾病, 为未来基因治疗提供了可能.
对树枝状分子外围的整体修饰可以更大范围地实现树枝高分子的改性. narayanaswamy等报道非病毒载体可以在分子水平进行修饰, 由此可得到基因载体.他们报道了可以进行有效基因转载的聚(醚亚胺)(petim)树枝状高分子(图 4).利用叔胺化合物为骨架分支点, 将正丙醚连接在它们的周边, 然后再利用伯胺分子进行末端修饰合成petim树枝状高分子.电子显微镜图显示, pegfp-c1-petim聚合物在对乳仓鼠肾细胞(bhk-21)进行转染8 h后, 在细胞核膜外部以及细胞核内均有聚合物的存在, 有力证明了petim-pegfp-c1聚合物可以转染到细胞浆中, 并且可以很好脱离内涵体进行基因转染.实验表明petim在很宽的浓度范围均显示较低的生物毒性; 并且它可以有效压缩质粒dna, 保护dna免受来自内涵体的损害, 从而把转载的dna安全输送到到细胞核内.
磷化树枝状分子具备其他阳离子没有的热稳定性(高达250 ℃), 并且在水中具有极佳的酸碱稳定性(ph从3到12)以及树枝分子空间灵活性.正是由于磷化树枝状分子的特殊性质使其得到广泛的应用. loup等通过连续控制片段分子h2n-n(me)-p(s)cl2的生长得到了五代磷化树枝高分子.最后通过对末端三级胺的甲基化修饰得到末端含96个胺基阳离子的五代磷化树枝状高分子(图 9).实验表明, 磷化树枝化末端叔胺质子化树枝分子在5 equiv.核苷酸下成功实现了对血清细胞中高效转染荧光素酶基因的转染.此外, 它们没有毒性, 并且在水溶液中非常稳定.作者后期将进一步研究评价这些新树枝状高分子在体内转染药物的性能.
含三嗪骨架的高分子利用胍胺上氮可以与dna上核酸碱基(胸腺嘧啶、尿嘧啶)形成相互交联的氢键实现对基因的转载.但是含三嗪骨架的高分子如聚(乙烯基三嗪4, 6-二氨-1, 3, 5-三嗪)基因载体的水溶解性差和转导效率低等缺点使其在临床应用中受到限制.而wang等将三嗪分子通过简单易行的方法修饰在树枝分子pamam上, 形成水溶性三嗪类树枝高分子(triazine dendrimers)基因载体.三嗪修饰的树状大分子可以高效地将相关凋亡诱导配体基因(trail, related apoptosis inducing ligand gene therapy)和增强功效蛋白(egfp)的绿色荧光基因转载到肉骨瘤细胞中(肉骨瘤mg-63细胞株).肉骨瘤是一种常在青少年中发展的恶性骨肿瘤.尽管近年来在治疗水平上有所提高, 但是仅有的5年生存率让患者的治愈率降低很多.此类基因载体与trail质粒进行复合, 对荷瘤小鼠进行注射治疗, 对应的基因表达蛋白质含量明显提高, 有效抑制肿瘤的生长, 肿瘤重量远远小于对照组, 达到基因治疗的效果, 具有临床应用的价值, 有望成为该病变的治疗手段. shao等进一步通过表面修饰树枝状大分子pamam合成了一系列的表面富含胍胺分子2, 4-二氨-1, 3, 5-三嗪(dat)的树枝状大分子(g5-dat55), 并且所合成树状大分子具有显著的转染效果且细胞毒性低(图 7).在非洲绿猴肾成纤维细胞(cos-7)中进行三维细胞培育, 结果表明, g5-dat55在对egfp基因转染试验中, 其效率优于代表性转染试剂lipo 2000和bpei(分子量: 25 kd).并且g5-dat55表现出更高的绿色荧光蛋白在3d细胞球内表达的能力.互补的多个氢改性配体与核酸碱基的键合作用在基因转染的成功中起着至关重要的作用.氢键调制策略在阳离子聚合物应用非常广泛, 在设计高效转染和减少细胞毒性基因载体上有突出贡献.后期他们将利用这一策略合成一系列高效率和低细胞毒性的高分子基因载体.
紫精树枝高分子基因载体
聚l-赖氨酸树枝状化嵌段基因载体
聚丙烯胺树枝状基因载体
聚乙二醇peg具有良好的水溶性, 并与许多有机物组分有良好的相溶性.正是由于peg的优良兼容性使得聚乙二醇在阳离子聚合基因载体中得到广泛应用. tamara等报道了三嵌段聚合物即聚酰胺-胺和聚(乙二醇)-多聚赖氨酸(pamam-peg-pll)纳米载体的设计、合成以及其转导sirna的研究(图 5).该基因载体解决了细胞中sirna转导中难以被细胞摄取、易于被内涵体吞噬、易于降解等问题.三元复合物集三个聚合物的优点于一体: (1) 聚酰胺团树枝状高分子作为质子海绵在内涵体逃逸和在细胞质中运载sirna发挥了至关重要的作用; (2) peg作为连接分子稳定和保护血浆中的sirna核酸; (3) 多聚赖氨酸(pll)上的胺基阳离子可以通过静电反应和带负电的dna结合.实验结果表明pamam-peg-pll可以很好地与sirna结合, 可以有效地被肿瘤细胞吸收, 并且可以诱导释放sirna上的靶向基因bcl-2b(淋巴细胞瘤-2基因).
聚氨基酸基础的基因载体
碳硅烷超支化基因载体
三嗪树枝状基因载体
2 与超分子母体材料结合的树枝状聚合物载体除了天然环糊精构建的基因载体外, 很多人工合成的超分子母体材料也被应用其中, 并且具有尺寸可控, 自由度更大等优点.葫芦脲分子是一种桶状的环状化合物.它的空腔是疏水的, 而且两端开口, 空腔两头比较小、中间很大, 可以包结有机分子. lim等报道的葫芦脲(cb)是一个由6个甘脲单位的亚甲基桥相互作用组成的大笼状化合物(图 13).他们利用cb与ppi-dab树状分子(1, 4-二氨基丁烷, 二聚)三代支化物以及dna自组装形成三元复合物. ppi-dab和葫芦脲(cb)被认定为一例完全组装的基因传递载体, cb与ppi-dab通过多个共价键相互作用, dna与ppi-dab通过静电内在反应生成三元复合物.动态光散射数据表明, 其粒径的大小和分布在150～210 nm内.荧光结果表明三元络合物中cb和ppi-dab是定量结合的. ppi-dab/cb复合物的细胞毒性相对较低并且能够在哺乳动物细胞内高效转染基因.
环糊精末端修饰的树枝基因载体
环糊精(cd)是由多个d(+)-葡萄糖单元通过α-1, 4-糖苷键首尾相连而成的环状化合物.正是由于cd具有“内疏水、外亲水”的特殊空间结构, 使得环糊精得到广泛的应用. shreyas等报道了基于环糊精修饰的树枝状聚酰胺-胺的基因输送体系(图 12).通过三-(2-氨乙基)胺与丙烯酸甲酯为单体进行迈克尔加成聚合然后氨解后得到末端为48个氨基的树枝状聚酰胺-胺, 将此化合物与对甲苯磺酰化的β-环糊精反应得到环糊精修饰的树枝状分子聚合体, 实验表明环糊精的增加有助于降低材料的毒性.同时环糊精树枝状聚酰胺-胺具有良好的质子缓冲能力, 能够有效浓缩pdna, 对外源性基因以及疏水性药物分子均能进行高效转载. huang等利用修饰的peg 2000与α-cd反应制备了聚轮烷, 再通过相应修饰形成的ppg1纳米颗粒基因载体可与pdna形成稳定的复合物胶体, 该ppg1超分子/质粒dna复合物(约100 nm直径)经过了256倍稀释后还是非常稳定, 并且保持其初始尺寸和分布; 体外细胞实验表明它在人胚肾细胞中运载pdna主要通过小胶囊依赖的途径, 而不是pei(分子量为25 k)依赖网格蛋白途径.
葫芦脲超支化基因载体
超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起, 组成复杂的、有组织的聚集体, 并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性.与超分子母体材料结合树枝状聚合物得到的基因载体可以有效地降低生物毒性、提高转染效率和增加靶向性, 合成该类智能型载体的方法包括改变立体结构、增加功能基团以及连接靶向分子等.尤其是利用分子识别能力和分子间超分子作用构建不同拓朴结构的智能基因载体越来越受到生物化学科学家的关注.
3 无机材料结合的树枝状聚合物载体石墨烯具有良好的导电、导热性以及电化学稳定性, 石墨烯材料被广泛应用在电化学、生物化学以及材料化学中. kim等通过修饰氧化石墨烯的官能团(go)赋予其特定的功能或结构属性(如易于控制合成、高水分散性、良好的胶体稳定性和生物相容性、可调的表面官能化等).因此它在生物医学领域如生物分子成像、药物基因载体和癌症治疗等方面吸引了越来越多的关注.他们以go为基础修饰上低分子量支化聚乙烯亚胺(bpei, 一种低分子量阳离子基因载体, 它可提高与dna结合率和转染效率)形成了有效的基因载体(图 15).细胞实验证实了bpei-go具有较高的转染效率和细胞活力.此外, go的bpei与go之间的共轭效应也增强了go的光致发光性能, 因此bpei-go可以作为生物体内的荧光试剂. yang等进一步研究在go上嫁接pamam大分子和镓离子.在姜黄素对胶质瘤u87细胞转载mirna后可以进一步利用石墨烯作荧光共聚显微镜, 用于化疗和核磁共振成像.这些实验结果表明镓偶联的树枝状高分子-氧化石墨烯配合物可作为有效的非病毒基因载体应用于基因转载和肿瘤的治疗.
holger等通过不同单体[如聚丙烯酸(paa)]修饰一步法制备了表面包覆羧基的水溶性磁性纳米颗粒(paaio).表面带负电荷的磁性纳米粒子可以很容易在水相中和支化聚乙烯亚胺结合.修饰上阳离子支化聚乙烯亚胺后的磁性载体可以与dna结合(图 16).由于pei-paaio/pdna较低的细胞毒性和良好的稳定性, 其作为基因载体和单独的pei和聚合物-磁性颗粒相比更加优越.虽然在肽牛血清存在时其基因转导的表达较低, 但当暴露在磁场中时, pei-paaio/pdna的基因转染效率显著增加. pan等以8 nm的超顺磁粒子为基础, 制备了超顺磁-五代聚酰胺-胺树枝状高分子复合物.该复合材料在细胞内表现出较高的转染效率.这些结果表明, pamam支化分子修饰的超顺磁性纳米颗粒是很好的基因载体并在癌症治疗以及影像学诊断都有潜在应用.溶胶-凝胶法(sol-gel法)同样用于超顺磁-树枝状基因载体的合成. gonzale等以共价键把ppi树枝状高分子接枝到磁赤铁矿纳米粒子(γ-fe2o3纳米颗粒)的表面.利用溶胶-凝胶法用烷氧基硅烷衍生物对铁氧化物纳米颗粒表面一步修饰上树枝状聚合物.溶胶-凝胶法合成的树枝状高分子的功能化的磁性纳米粒子可以形成稳定的亲水性胶体溶液.亲水性磁性溶胶的合成有利于磁性纳米粒子在生物医学中应用.
纳米金即指金的微小颗粒, 其直径在1～100 nm, 具有高电子密度、介电特性和催化作用, 能与多种生物大分子结合, 且不影响其生物活性.引入靶向分子可以有效提高基因的靶向传递, 实现靶向细胞的选择性转染. shi等报道了利用叶酸分子修饰后可作为靶向基因载体的金纳米-支化粒子(au denps-fa).它与质粒dna可自组装成聚合物, 凝胶阻滞实验、动态光散射和zeta电位实验均表明其有效压缩质粒dna形成的复合物具有小尺寸且表面带正电荷(图 14). au denps-fa的基因转染实验表明其可高效和特异地在hela细胞上进行转染荧光素酶基因(luc), 并且可以增强绿色荧光蛋白(egfp)基因的转导. shan等的工作表明金纳米粒子可以维持树枝状高分子的模板, 刚性金纳米粒子包覆在树枝状高分子的内部有助于保护树枝状分子的树枝状三维球面, 因此具有更多结合dna的位点.他们利用五代树枝状分子氨基修饰的denps(树枝状分子)与金纳米粒子结合能够显著提高树枝状聚合物致密压缩dna的能力. au-denps被用作基因载体在体外对不同细胞系的荧光素酶(luc)和绿色荧光蛋白(egfp)均能高效转载.
石墨烯复合的超支化基因载体
磁性纳米颗粒结合的超支化基因载体
量子点是在纳米尺度上的原子和分子的集合体, 既可由一种半导体材料组成, 如由iib-via族元素(如cds, cdse, cdte, znse等)或iiia-va族元素(如inp, inas等)组成, 也可以由两种或两种以上的半导体材料组成.作为一种新颖的半导体纳米材料, 量子点具有许多独特的纳米性质. endres等报道了两亲性生物可降解嵌段共聚物peg-pcl-pei自组装生成的含一个外围亲水性聚乙二醇(peg)和内核疏水性聚己内酯(pcl)的纳米载体.并且通过调控三个单体的比例可以控制纳米载体的物化性质. peg由于其较好的亲水性降低了生物毒性, 而支化的pei在亲水疏水核的周围可以很好地复合核酸.疏水性内核可以携带疏水性药物以及荧光染料或量子点.量子点的核壳结构(如cdse/zns)可以包覆进聚合物组装的纳米载体疏水层中, 而且亲水层的外延可以将量子点保持在水溶液中.量子点较宽的激发波范围可用于体内体外环境的成像.三聚复合物peg-pcl-pei是集治疗成像于一体的多功能纳米基因载体.
无机材料具有很多优异的特性(比如热辐射性, 磁性等), 特别是无机纳米颗粒, 往往具有宏观所没有物理化学性能.纳米材料指的是纳米结构按一定方式堆积或一定基体中分散形成的宏观材料.无机纳米结构为至少一维尺寸在1～100 nm区域的结构, 它包括纳米粒子、纳米纤维、纳米薄膜、纳米块状和纳米晶等.树枝状分子树枝状聚合物与不同无机物的结合, 赋予树枝状基因载体新的生命力.
金纳米颗粒结合的树枝基因载体
4 功能响应性的树枝状聚合物载体综上所述, 基于树枝状聚合物及其衍生物在体内体外多种细胞组织实现了高效基因转载, 可以实现靶向性以及多功能抗癌治疗.基于树枝状聚合物基因载体由于树枝高分子/超支化分子具有无基因尺寸限制、可大量生产且产品质量重复性好、价格低、使用简单方便、易于修饰、灵活多变等优点而受到研究者的广泛关注.树枝聚合物基因载体为未来非病毒载体的发展开拓了新的领域.
除了上述的ph响应型基因载体, 利用二硫键响应的氧化还原型基因载体报道也很多. ping等制备了一系列含有二硫键的生物可降解的超支化聚酰胺-胺, 该高分子以三级胺为核心, 同时利用聚乙二醇、n-氨乙基piperazine(aepz)进行末端修饰(图 18).该分子中具有的还原响应性的二硫键在细胞质中被还原物质迅速降解, 能实现dna的智能释放, 使得该类双重响应性聚酰胺-胺的转染效率远高于非响应性的聚酰胺-胺.原子力显微镜(afm)图显示这种高分子能够与dna复合从而得到稳定的、带正电荷的粒径为50～200 nm的纳米颗粒.实验表明paa末端基团结构显著影响基因体外活转染, 而末端叔胺修饰的paa可以安全高效进行基因传递. russ等利用叠氮基修饰的聚天冬氨酸-琥珀亚胺为主链物质, 通过click反应与炔基修饰的双硫键pei分子偶联得到了聚天冬氨酸基础上的刷状聚乙烯亚胺衍生物.体外实验显示该聚合物可以高效压缩dna, 被细胞内吞后, 二硫键在细胞内打开, 迅速释放包覆的dna.
虽然传统型的树枝状聚合物基因载体应用广泛, 不同类别的树枝分子各有所长, 并在不同肿瘤细胞中发挥基因治疗作用, 特别是氨基酸及多肽的修饰, 实现了在特定细胞或体内组织的转染靶向性.但是他们本身的生物毒性和细胞相容性限制了其发展, 所以需要对树枝高分子进行化学修饰以弥补其本身的不足.通过对树枝高分子的修饰, 可以增加细胞的摄取率, 提高其在生物体内转染基因的效率, 拓展了树枝高分子在基因治疗中的应用范围.超分子母体材料的修饰提高了树枝聚合物的细胞膜穿透力, 并且可以构建不同拓扑结构的智能基因载体; 并且超分子母体材料疏水性的内腔可以包结脂溶性药物, 实现多功能基因治疗.但是超分子母体材料本身需要进行单取代、多取代等官能团修饰后才能与树枝高分子结合.而且除了天然的环糊精外, 其他的超分子母体材料都是需要繁杂的有机合成步骤合成进行, 使其应用受限.无机物的修饰赋予树枝状聚合物新的性质, 使得多功能型基因载体应运而生.然而无机物本身容易在体内产生抗原抗体反应, 必须经过修饰处理形成水溶性/生物相容性等才能在体内进行安全基因治疗.而功能响应型的树枝状聚合物基因载体, 如ph响应、二硫键响应可以提高血清抵抗性及细胞相容性.氟功能化树枝分子提高了细胞摄取率以及内涵体的脱离.但是目前关于功能响应的树枝基因载体在体内体外的转染的临床治疗工作还是比较缺乏.总之, 树枝状聚合物通过物理或化学方法将多种有机无机材料结合在一起进行多功能疗法, 该疗法中采用了抗癌药物、靶向配体、显像剂等相结合的方式.这将打开安全有效多功能抗肿瘤靶向基因治疗的大门.
6总结和展望
huang等利用谷氨酸和赖氨酸不同的pka值, 设计合成了ph响应型的聚多肽分子.由于带正电荷的纳米载体在血液中具有很强的非特征性的细胞摄取能力, 并且与血清发生强烈的相互作用, 导致其在体内的严重沉聚而很快被循环清除, 从而限制了其应用(图 17).基于以上原因, 他们设计合成了聚谷氨酸-共-赖氨酸的共聚体, 将其与顺铂络合形成新的肿瘤细胞外ph值触发的电荷逆转顺铂聚(谷氨酸-共-赖氨酸).由于共聚物等电点的影响, 其在血液中(ph=7.4)带负电而具有较长的半衰期, 而在达到癌症区域(ph=6.8)后会转变成带正电荷的大分子, 因而可以提高肿瘤细胞的摄取率. ph响应型的超支化分子不仅利于基因的运载, 也利于疏水性药物在体内的释放与吸收. lakkakula等利用ph引发缩醛乙酰化α-cd纳米粒子与紫杉醇自组装形成基因载体.在较低的ph值下复合体分解, 释放出紫杉醇.体外和体内研究研究证明紫杉醇的运载和基因转载能力均有较高效率.
树枝化聚合物除了在结构式修饰、嵌合得到优良性质的树枝状基因载体以外, 还在功能响应基因载体方面有着突破性进展.由于人体内复杂的细胞内外液环境以及各类生物活性酶的存在, 在体内实现基因转载有很多障碍.因此能实现ph或者其他功能响应型的树枝状聚合物基因载体在临床有更广阔的应用.
氟修饰的树枝基因载体
含氟化合物被广泛地应用在材料、催化以及生物医学领域中.由氟修饰的树枝状高分子具有疏水又疏脂的特殊性质.氟取代的树枝高分子由于其易于合成、卓越的转染效率和低的细胞毒性为传统树枝状聚合物基因载体开辟了新的研究领域.研究表明氟功能化树枝分子可显著提高细胞摄取率以及内涵体的脱离. liu等利用五氟丁酸酐、七氟丁酸酐和九氟丁基磺酸酐为氟源将五代pamam进行氟代化(图 19).作者进一步利用yoyo-1 (y3601)标记的dna[同时利用lyso-tracker red(溶酶体红色荧光探针)标记的内涵体]在hela细胞中进行细胞转染, 共聚焦显微镜(白色箭头)显示yoyo-1标记的dna在细胞内涵体中出现.实验表明氟代化的pamam树枝高分子作为基因载体在人体肾脏上皮细胞(hek293细胞)和宫颈癌细胞(hela细胞)中的应用均取得很好转载效率(90%).氟代化的树枝状高分子可以极大地提高基因载体的细胞转染效率并降低细胞毒性.后期研究结果表明氟代化的三、四、五代聚(丙烯亚胺)(ppi)在体外细胞转染中也表现出很好的效率.
非病毒载体包括阳离子脂质体、树枝状聚合物和多肽都为基因载体提供了新途径.不少病毒载体的基因治疗实现了从实验室进入临床试验过程, 已经批准的基因治疗临床试验方案有数千项, 其中大部分都是针对恶性肿瘤的治疗, 但是安全转载效率高的非病毒载体的需求仍然迫切.而树枝状聚合物基因载体临床治疗工作还是比较少.树枝聚合物的引入可以很好地构建多种构型的基因载体, 为载体的功能化和靶向型提供更多的选择性.随着对树枝状聚合物分子的深入研究, 树枝状聚合物分子在基因转载上的运用会越来越广泛.以树枝状聚合物为基础的树枝状聚合物基因药物输送和基因运载作为临床上可行的抗癌疗法将会得到越来越多科学家的亲睐.
ph响应的基因载体的转导
氧化还原响应型的超支化基因载体的转导
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